BIOTEKNOLOGI – PLASMID BAKTERI

PLASMID BAKTERI … Apa itu…?

1.1  Pengertian Plasmid

     Pada umumnya bakteri mempunyai kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkulasi atau DNA yang berbentuk lingkaran. Di samping memiliki DNA sirkulasi lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Jadi plasmid adalah elemen genetika terkecil yang mampu bereplikasi pada bakteri atau ragi.

1.2  Beberapa Tahap Untuk Mengklonkan Gen Atau Fragmen DNA

1. Pemotongan Plasmid

     Plasmid pBR322 di potong di dalam tabung reaksi menggunakan enzim Pstl maka pBR322 akan terpotong pada bagian gen APR.

1. Menyisipkan Gen Atau Fragmen DNA

     Bila pBR322 yang sudah terbuka lingkarannya di campur dengan potongan DNA asing dan kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah berupa campuran yang berisi:

• Plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran lagi seperti semula.
• Plasmid rekombinasi yaitu pBR322 yang telah di sisipi oleh DNA asing.

1. Memasukkan DNA Ke Dalam Sel Bakteri (Trasformasi)

     Campuran kedua bentuk plasmid ini kemudian di campurkan dengan kumpulan sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid. Kemudian hasilnya berupa campuran yang berisi:

• Sel bakteri yang mengandung plasmid pBR322 tanpa sisipan.
• Sel yang mendapat plasmid rekombinasi (pBR322) yang telah di sisipi DNA asing.

1.3  Seleksi  Klon Bakteri Yang Mengandung  Plasmid Rekombinan

1. Seleksi Menggunakan Antibiotik

     Salah satu cara untuk menyeleksi klon yang benar adalah dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.

     Cairan suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara bakteri,plasmid,dan DNA asing yang telah di perlukan dalam rangka trasformasi) di sedarkan pada media yang mengandung tetasiklin. Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-masing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian di pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada media + ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya mengandung plasmid rekombinasi).

1. Seleksi Berdasarkan Aktifitas Enzim B-galactosidase

     Enzim B- galactosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5 – bromo – 4chloroindigo (biru). Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru bila di tumbuhkan pada media yang mengandung Xgal.

     Pada lacZ terdapat daerah yang di sebut daerah polikloning. Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dan berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ. Dengan demikian kita dapat menyisipkan DNA asing pada bagian lacZ. Bila gen lacZ di sisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan B – galactosidase)

     Bila kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai plasmid vector, maka koloni yang membawa plasmid rekombinasi dapat di deteksi dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung Xgal (5 – bromo – 4 – chloro – indolyl – b – D – galactoside).

     Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru karena ada gen lacZ yang menghasilkan B- galactosidase. Enzim B- galactosidase memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5 – bromo – 4 – cholorindigo yang berwarna biru.

     Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah di sisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini gen lacZ tidak berfungsi karena di sisipi DNA asing. Jadi, koloni yang mengandung plasmid rekombinan adalah koloni yang berwarna putih.

1.4  Metode Yang Dgunakan Untuk Transformasi Plasmid DNA

1. Metode CaCl

     Metode ini cukup efisien dan tidak membutuhkan alat khusus. Dagert dan Ehrlich (1974) memodifikasi metode ini dengan meningkatkan lama paparan sel terhadap CaCl2. Kushner (1978) berusaha meningkatkan efisiensinya dengan menggantikan kalsium dengan kation lainnya . Sedangkan Hanahan (1983) menambahkan beberapa senyawa lain untuk meningkatkan efisiensinya.

1. Metode Elektroporasi

     Transformasi plasmid DNA metode elektroporasi adalah metode transformasi yang paling efisien. Metode ini juga dapat digunakan untuk mentransformasikan DNA ke dalam bakteri gram negatif dan positif lainnya (tidak hanya E. coli).

1. Metode Kalsium – Fosfat

     Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Wigler dkk (Wigler et al, 1979) dan disempurnakan oleh Chen-Okayama (Chen and Okayama, 1987). Kelebihan dari metode ini adalah relatif murah dan mempunyai transformasi efisiensi yang cukup tinggi, baik untuk transfeksi transien maupun transfeksi stabil. Berikut adalah metode yang dipublikasikan oleh Chen dan Okayama, untuk transfeksi menggunakan petri yang berdiameter 35 mm.